Trois ans après avoir noué des amitiés avec les animations du Musée d'histoire naturelle de New York alors qu'il y était gardien de nuit, Larry Daley dirige maintenant sa propre société de télévision de télé-achat qui vend des inventions basées sur ses expériences. Il se rend au musée, découvrant que la plupart des annimations du musées, ses personnages de cire et de caoutchcouc, seront transférés aux archives fédérales de la Smithsonian Institution et remplacées par des animations holographiques. La tablette d'Ahkmenrah doit rester dans le musée, laissant la plupart des animations sans possibilité de prendre vie la nuit.
Une fois les animations déplacées, Larry reçoit un appel téléphonique de Jedediah, qui l'informe que Dexter le singe a volé la tablette et l'a apportée au Smithsonian, donnant vie à chaque pièce. Larry se rend à Washington, DC, se dirigeant vers les archives avec l'aide de son fils Nick tout en se faisant passer pour un gardien de nuit. La tablette donne vie aux animations mais celles-ci se trouvent piégées dans leur conteneur d'expédition par l'attaque du frère aîné diabolique d'Ahkmenrah, Kahmunrah. Activant accidentellement la tablette et redonnant vie aux objets exposés dans le Smithsonian, Kahmunrah révèle son intention d'utiliser les pouvoirs de la tablette pour conquérir le monde.
Larry s'échappe, aidé par une gigantesque pieuvre et le général George A. Custer. Celui-ci capturé, c'est Amelia Earhart qui veut participer à l'aventure. Tout deux échappent à l'armée de Kahmunrah, les piégeant dans le portrait de V-J Day à Times Square (Alfred Eisenstaedt,1945). Kahmunrah fait appel à un trio de chefs historiques maléfiques : Ivan le Terrible, Napoléon Bonaparte et Al Capone pour lui servir de lieuteant en commançant par l'aider à capturer Larry et récupérer la tablette. Jedediah, capturé, est placé dans un sablier. Kahmunrah est incapable d'ouvrir la porte des enfers sans la tablette, et donne à Larry et Amelia une heure pour la traduire, ou Kahmunrah laissera Larry etouffer dans le sablier et tuera ses amis. L'amitié de Larry et Amelia augmente au point qu'ellet finit par l'embrasser avec les chérubins volants "Gods of Love" qui leur chantent "My Heart Will Go On".
Larry et Amelia se rendent au National Air and Space Museum pour trouver de l'aide, croisant brièvement la statue d'Abraham Lincoln au Lincoln Memorial. À l'intérieur du musée, Larry empêche in extremis tous les avions et les fusées de décoller. Le groupe de têtes en caoutchcouc d'Albert Einstein l'informe que la combinaison est la valeur de pi. Amelia essaie de convaincre Larry de former un couple, mais Larry a du mal à lui dire la vérité : elle est faite de cire, ce qui les empêche d'être ensemble.
Napoléon, Ivan et les troupes de Capone arrivent, obligeant Larry et Amelia à s'échapper en utilisant le Wright Flyer. Leur avion s'écrase dans le Smithsonian, où Kahmunrah utilise la combinaison acquise pour invoquer une armée de guerriers Horus. Lincoln se précipite par la fenêtre, effrayant les guerriers qui retrournent dans le monde souterrain.
Amelia rassemble une armée d'alliés, dont les amis de Larry et Custer, menant à une bataille ultime. Mais Custer a peur de se battre après s'être souvenu de la bataille de Little Big Horn. Larry le persuade d'oublier le passé et de continuer. Pendant ce temps, Octavius sauve Jedediah; et ensemble, ils inversent le cours de la bataille. Larry obtient la tablette et élabore un plan pour arrêter Kahmunrah. Inspiré par une idée que lui a donnée Lincoln, Larry suscite un désaccord entre Capone, Bonaparte et Ivan, les faisant se bagarrer entre eux. Larry tente de s'échapper, mais est coupé par un Kahmunrah en colère, brandissant un Khopesh. Après une brève bagarre entre Larry, armé de sa lampe de poche, et Kahmunrah, Amelia parvient finalement à utiliser la tablette pour ouvrir la porte, et Larry bat finalement Kahmunrah et le bannit aux Enfers.
Amelia ramènet Larry et les animations à New York en avion. Même si Larry aime Amelia, ils savent tous les deux qu'elle doit partir, sachant qu'elle deviendra poussière avant d'atteindre le Smithsonian. Cependant, les deux partagent un dernier baiser avant qu'elle ne décolle.
Deux mois plus tard, Larry vend son entreprise, faisant secrétement don de l'argent au musée pour le rénover et le garder ouvert plus tard dans la nuit. Les animations doivent rester aussi mais peuvent se déplacer la nuit sous prétexte d'être des hollogrames. Larry est réembauché comme gardien de nuit . Il aide une femme nommée Tess qui ressemble à Amelia lors des débuts de la nouvelle extension des heures de visite du musée.
La galerie de peinture est censée être celle du Smithsonian American Art Museum (SAAM), l'un des dix neuf musées de la Smithsonian Institution situés sur le National Mall à Washington. Les tableaux sont cependant filmés dans la toute proche et prestigieuse National Gallery of Art (NGA). Si l'on reconnait les colonnes de marbre et les bassins avec fontaines de ce prestigieux musée, on n'y voit aucun tableau de cette collection ! Les tableaux viennent en effet de nombreux musées, américains en majorité mais européenns aussi. Ce musée composite est ainsi appelé The Washington Art Museum (WAM) avec un logo que l'on voit décliné dans les différentes salles.
L'intérêt de constituer un tel musée composite dans une comédie populaire est de pouvoir montrer à un public souvent peu sensibilisé à l'art des musées, des tableaux qu'il peut néanmoins connaitre. Une sorte de pot-pourri de la culture picturale populaire :
Crying girl (Roy Lichtenstein, 1964, Milwaukee Art Museum), Patinage dans Central Park (Agnes Tait, 1934, Smithsonian American Art Museum), American gothic (Grant Wood, 1930, Art Institute of Chicago), Nighthawks (Edward Hopper, 1942, Art Institute of Chicago), Ballon en forme de chien (Jeff Koons, 1994), Three flags (Jaspers Johns, 1958, Whitney Museum), Convergence (Jackson Pollock, 1952, Buffalo, Albright-Knox Art Gallery), Love (Robert Indiana, 1970, Love park, Philadelphie), 'Now for the Painter' (Rope) (William Turner, 1807, Manchester Art Gallery), Danseuse de 14 ans (Edgar Degas), Le penseur (Auguste Rodin, Musée Rodin, Paris), Vénus italica (Antonio Canova, 1815, North Carolina Museum of Art)