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Sur Terre, en 1988, le jeune Peter Jason Quill rend visite à sa mère à l'hôpital. Cette dernière est atteinte d'un cancer en phase terminale. Elle donne un cadeau à Peter, un walk-man puis meurt. Peter s'enfuit en pleurs, avant d'être aspiré par un vaisseau spatial.
Vingt-six ans plus tard, Peter arrive sur une planète abandonnée du nom de Morag. Il est devenu Star-Lord, un hors-la-loi qui travaille avec les Ravageurs, une bande de mercenaires. Équipé de divers gadgets et de son précieux walk-man, il vole un orbe et s'enfuit après un court combat contre les hommes de Korath, qui travaille pour un Kree nommé Ronan l'Accusateur. Mais le chef des Ravageurs, Yondu Udonta, découvre son larcin et offre une récompense pour sa capture. Ronan a promis à Thanos, le Titan fou, un des êtres les plus puissants de l'univers, de lui apporter l'Orbe, en échange de quoi Thanos réduira la planète Xandar, la capitale de l'empire Nova, en poussière. En effet, après mille ans de guerre entre l'empire Nova et l'empire Kree qui ont débouché sur la signature d'un traité de paix, Ronan veut détruire Xandar pour venger le peuple Kree. Il envoie la tueuse Gamora pour récupérer l'Orbe.
Quand Peter Quill essaye de vendre l'Orbe sur Xandar à un acheteur surnommé « le Courtier », celui-ci prend peur en apprenant par Peter qu'un partisan de Ronan voulait l'objet aussi et le renvoie. Gamora tend ensuite une embuscade à Quill et lui prend l'Orbe. Deux chasseurs de primes prennent alors part au combat : un raton laveur génétiquement modifié, Rocket, et un humanoïde semblable à un arbre, Groot. Les Cohortes de Nova, les forces armées de Xandar, arrivent, arrêtent les quatre combattants et les emprisonnent au Kyln, une prison spatiale de haute sécurité. Là-bas, Gamora est menacée par des prisonniers, notamment Drax le Destructeur, qui essaye de la tuer car Gamora travaille pour Ronan et que ce dernier a tué la femme et la fille de Drax. Peter le dissuade en disant que Gamora peut attirer Ronan. Mais la jeune femme avoue qu'elle a trahi Ronan, car elle ne veut pas le laisser utiliser le pouvoir de l'Orbe.
Ronan rencontre le père adoptif de Gamora et de Nébula, Thanos, dans un champ d'astéroïdes nommé le Sanctuaire, le domaine de ce dernier. Pendant sa conversation avec Thanos, Ronan tue « l'Autre », le serviteur du titan qui avait organisé l'attaque de New York avec Loki, à la suite d'une provocation. Thanos accuse Ronan de la trahison de Gamora et de la perte de l'Orbe.
Un peu plus tard, les quatre prisonniers, accompagnés de Drax, s'échappent de la prison dans le vaisseau de Peter, le Milan (dans la version originale, le vaisseau se nomme le Milano, en référence à Alyssa Milano). Ils se rendent sur l'astéroïde Knowhere (la tête coupée d'une antique créature céleste) qui sert depuis des centaines d'années de colonie minière au Groupe Tivan. Drax, ivre, envoie un message à Ronan pour qu'il vienne et qu'il puisse se venger, tandis que le reste de la bande accompagne Gamora chez son acheteur pour l'Orbe, Taneleer Tivan alias le Collectionneur. Tivan ouvre l'Orbe, révélant une des six Pierres d’Infinité : ce sont des pierres dont les origines remontent avant la création de l'univers, et elles ont chacune un pouvoir destructeur. Mais seuls les êtres dotés d'une force surnaturelle peuvent les manipuler. Soudain, la domestique de Tivan essaye de dérober la pierre, mais elle est désintégrée, déclenchant une explosion qui détruit le Musée du Collectionneur.
Ronan arrive sur Knowhere et bat facilement Drax en combat singulier, tandis que les autres fuient dans de petits vaisseaux, poursuivis par les partisans de Ronan et la sœur de Gamora, Nébula. Cette dernière détruit le vaisseau de Gamora, la laissant gésir dans l'espace, et s'empare de l'Orbe. Peter contacte Yondu et donne son casque à Gamora afin qu'elle survive. Yondu arrive sur les lieux et les récupère. Peter réussit à conclure une trêve avec le chef des Ravageurs en le convainquant qu'ils peuvent récupérer l'Orbe. Les cinq compagnons savent que l'affrontement avec Ronan signifie une mort certaine, mais ils comprennent qu'ils doivent l'arrêter pour l'empêcher de détruire Xandar, voire la galaxie entière.
Sur son vaisseau, l'Astre Noir (un destroyer Kree), après avoir découvert que l'Orbe contient une Pierre d'Infinité, Ronan trahit Thanos. Il enfonce la pierre dans son bâton et arrive à maîtriser l'énergie de la pierre. Ronan menace Thanos en lui disant qu'une fois qu'il aura détruit Xandar, il viendra lui régler son compte. Nébula, dès lors, fait le choix de trahir son père adoptif et de rejoindre Ronan.
Dans le ciel de Xandar, l'Astre Noir est attaqué par les appareils des Cohortes de Nova, ceux des Ravageurs et le Milan, qui réussit à infiltrer le destroyer Kree. Tandis que Ronan utilise son bâton pour détruire les vaisseaux des Cohortes qui empêchent son destroyer de se poser au sol, Drax tue Korath. Gamora bat Nébula, qui s'enfuit, et réussit à ouvrir les portes de la pièce où se trouve Ronan. Grâce à une arme de Rocket, Peter tire sur Ronan, ce qui déclenche une énorme explosion. Le destroyer tombe sur Xandar et Groot se sacrifie en faisant de lui un bouclier pour protéger ses amis. Après le crash de son vaisseau, Ronan sort de l'épave indemne et se prépare à détruire Xandar, mais Peter le distrait en dansant et en chantant, invitant même Gamora à le rejoindre - celle-ci refuse -, ce qui permet à Drax et Rocket de détruire le bâton de Ronan. Peter saisit alors la pierre avant qu'elle n'atteigne le sol et commence à subir ses effets destructeurs. Mais Gamora, puis Drax et Rocket s'unissent pour partager avec lui l'énergie de la pierre, ce qui leur permet de ne pas être désintégrés. Grâce à cette énergie, Peter anéantit Ronan.
Immédiatement après cette victoire, Yondu exige de recevoir la pierre conformément à l'accord passé avec Star-Lord. En quittant la planète, Kraglin, l'un des ravageurs, dit à Yondu que c'était une bonne chose de ne pas avoir ramené Peter à son père comme ils étaient censés le faire. De son côté, Peter a réussi à duper Yondu et confie le nouvel orbe renfermant la pierre aux Cohortes de Nova. Ces dernières effacent les casiers judiciaires du groupe de Peter, maintenant connu sous le nom de Gardiens de la Galaxie. Peter apprend qu'il est seulement à moitié terrien, son père étant un être d'une origine très ancienne et inconnue. C'est grâce à cette origine que Peter et les trois autres Gardiens n'ont pas été désintégrés par la pierre. Peter ouvre finalement le dernier cadeau qu'il a reçu de sa mère : une bande pour magnétophone qui contient ses chansons préférées. Les Gardiens quittent Xandar à bord du Milan, acceptant de se placer sous le commandement de Star-Lord.
Scène post-générique : Dans son musée dévasté, le Collectionneur, hébété, boit un cocktail. Le chien Cosmo vient lui lécher le visage. Howard the Duck, buvant également un cocktail, déclare qu'il ne comprend pas comment il peut accepter de se faire lécher comme ça.
Les gardiens de la galaxie est l'adaptation cinématographique des comics du même nom, créés en 1969. Cependant, les personnages utilisés correspondent davantage à la « seconde équipe », développée par Dan Abnett dès 2008. Le coproducteur Jonathan Schwartz explique ce choix car "le ton du comic était plus sympa et irrévérencieux, et l'histoire apparaissait contemporaine, mais dans le sens cool du terme"
Les Gardiens de la Galaxie est la dixième étape de l'univers cinématographique Marvel inauguré six ans auparavant avec Iron Man (Jon Favreau, 2008) et fait partie de la phase deux. Il s'agit aussi du premier film de cet univers qui ne soit pas centré sur un membre des Avengers depuis sa création. Toutefois plusieurs allusions avaient été glissées dans des scènes post-générique des films précédents. À la fin de Thor : Le Monde des ténèbres, on voyait Sif et Volstagg apporter l'une des pierres d'infinité au Collectionneur, qui a un rôle plus important dans Les Gardiens de la Galaxie. Par ailleurs, tout à la fin d'Avengers (Joss Whedon, 2012) on découvrait brièvement une partie du visage de Thanos, que l'on peut voir entièrement ici et plus longuement..
Aux États-Unis et au Canada, le film réalise 94 320 883 $ de recettes pour son premier week-end d'exploitation, battant ainsi le record du meilleur démarrage au mois d'août de tous les temps. Le film est suivi en 2017 de Les Gardiens de la Galaxie Vol. 2.