James Gunn nait et grandit à Saint-Louis, dans le Missouri1. Il a quatre frères, Sean, Bryan, Matt (tous trois travaillent dans le cinéma comme acteur ou scénariste) et Patrick, et une sœur, Beth. À l'âge de 12 ans, il commence à faire films amateurs en 8 mm avec son frère Sean.

Après avoir fréquenté l'Université Columbia, il rejoint la société Troma Entertainment de Lloyd Kaufman, spécialisée dans la production de films trash de série B et de nanars volontaires. En 1996, il participe à l'écriture de Tromeo and Juliet. Après avoir travaillé sur d'autres films Troma Entertainment, il quitte l'entreprise et écrit le scénario de la comédie de super-héros The Specials (2000), mis en scène par Craig Mazin.

En 2000, il publie le roman The Toy Collector , édité chez Bloomsbury Press. L'histoire est celle d'un employé d'hôpital revendant des médicaments pour se payer des jouets de collection. Il coécrit également le livre All I Need to Know About Filmmaking I Learned from the Toxic Avenger avec Lloyd Kaufman, qui est une sorte d'autobiographie de ce dernier.

En 2002, il participe à un film à plus gros budget à Hollywood : le film Scooby-Doo de Raja Gosnell, adapté des productions télévisées Hanna-Barbera. En 2004, il participe au scénario initial de L'Armée des morts de Zack Snyder mais quitte le projet pour Scooby-Doo 2 : Les monstres se déchaînent, qui sort en 2004. La même année, il participe au film documentaire parodique de Jenna Fischer, LolliLove.

Il fait ses débuts à la réalisation avec la comédie horrifique Horribilis, qui sort en 2006.

En 2008, il est juge dans l'émission de téléréalité Le Casting de l'Horreur (Scream Queens) diffusée sur VH1 afin de trouver une actrice pour le film Saw 6. Il lance également la web-série humoristique PG Porn située dans l'univers du cinéma pornographique. En 2009, la série est adaptée en France par Canal+ sous le titre Du hard ou du cochon!.

En 2009, il développe le projet Pets, qu'il prévoit de réaliser. Cette comédie avec Ben Stiller voit des aliens transformer des humains en animaux de compagnie. En mars 2009, le projet est finalement abandonné.

Son second film comme réalisateur est Super, une comédie noire et satirique sur les super-héros avec Rainn Wilson et Elliot Page dans les rôles principaux.
En septembre 2012, il est confirmé comme réalisateur du blockbuster Les Gardiens de la Galaxie le dixième chapitre de l'univers cinématographique Marvel.

Il réalise l'un des sketches de la comédie My Movie Project, sorti en 2013.

Les Gardiens de la Galaxie sort durant l'été 2014, et connait un succès critique et commercial mondial : le film produit par Marvel Studios rapporte en effet plus de 775 millions de dollars. Il reste ensuite dans l'univers cinématographique Marvel en réalisant Les Gardiens de la Galaxie Vol. 2 (sorti en 2017) et en tant que coproducteur de Avengers: Infinity War (2018).

Alors qu'il finalise le script du troisième film sur les Gardiens de la Galaxie, prévu pour 2020, des blagues sur la pédophilie qu'il a postées sur les réseaux sociaux en 2009 sont retrouvées et mises en avant par des figures de l'alt-right américaine. Peu après, Disney annonce que Gunn est renvoyé du poste de réalisateur du film. Le réalisateur se défend en évoquant un humour noir qui ne lui correspond plus, rappelant qu'il était déjà revenu sur ses propos passés, mais accepte la décision. Le studio confirme un mois plus tard que Gunn ne réalisera pas le film mais son script sera conservé.

Après son renvoi de Disney/Marvel, Gunn est approché par Warner Bros pour écrire Suicide Squad 2, la suite du troisième film de l'univers cinématographique DC Suicide Squad et éventuellement le réaliser. Cependant il est annoncé le 16 mars 2019 qu'il est réembauché par Marvel pour la réalisation du 3e film des Gardiens de la Galaxie pour une sortie en 2020. Devant l'absence de date de sortie pour Les Gardiens de la Galaxie Vol.3 annoncée lors du Comic-con de San Diego de 2019, Gunn répond sur Twitter qu'il réalisera d'abord The Suicide Squad  (2021) avant de revenir sur le film Marvel.

Il débute ensuite le tournage de Les Gardiens de la Galaxie Vol. 3 qui sort en 2023.

En octobre 2022, il est nommé par Warner Bros. Discovery comme co-PDG de DC Films, devenu DC

Filmographie :

2006	Horribilis
2010	Super
2014	Les gardiens de la galaxie
	(Guardians of the Galaxy). Avec : Chris Pratt (Peter Quill), Zoe Saldana (Gamora), Dave Bautista (Drax), les voix de Vin Diesel (Groot) et Bradley Cooper (Rocket), Lee Pace (Ronan), Michael Rooker (Yondu Udonta), Karen Gillan (Nebula), Djimon Hounsou (Korath). 2h01. Peter Quill est un aventurier traqué par tous les chasseurs de primes pour avoir volé un mystérieux globe convoité par le puissant Ronan, dont les agissements menacent l’univers tout entier. Lorsqu’il découvre le véritable pouvoir de ce globe et la menace qui pèse sur la galaxie, il conclut une alliance fragile avec quatre aliens disparates : Rocket, un raton laveur fin tireur, Groot, un humanoïde semblable à un arbre, l’énigmatique et mortelle Gamora, et Drax le Destructeur, qui ne rêve que de vengeance. En les ralliant à sa cause, il les convainc de livrer un ultime combat aussi désespéré soit-il pour sauver ce qui peut encore l’être …
2017	Les gardiens de la galaxie 2
	(Guardians of the Galaxy Vol. 2). Avec : Chris Pratt (Peter Quill), Zoe Saldana (Gamora), Dave Bautista (Drax), les voix de Vin Diesel (Groot) et Bradley Cooper (Rocket), Lee Pace (Ronan), Michael Rooker (Yondu Udonta), Karen Gillan (Nebula), Pom Klementieff (Mantis), Sylvester Stallone (Stakar Ogord), Kurt Russell (Ego). 2h16. Les Gardiens de la Galaxie doivent lutter pour garder leur nouvelle famille unie lorsqu'ils percent le mystère de la véritable filiation de Peter Quill.
2021	The Suicide Squad
	Avec : Margot Robbie (Harley Quinn), Idris Elba (Bloodsport), John Cena (Peacemaker), Joel Kinnaman (Colonel Rick Flag), Michael Rooker (Savant), Viola Davis Viola Davis (Amanda Waller). 2h12. Les super-vilains Harley Quinn, Bloodsport, Peacemaker et une belle collection d'escrocs à la prison de Belle Reve rejoignent la super secrète et super louche Task Force X, sur l'île lointaine et bourrée d'ennemis de Corto Maltese.
2023	Les gardiens de la Galaxie 3
	(Guardians of the Galaxy Vol. 3). Avec : Chris Pratt (Peter Quill), Zoe Saldana (Gamora), Dave Bautista (Drax) les voix de Vin Diesel (Groot) et Bradley Cooper (Rocket), Karen Gillan (Nebula), Pom Klementieff (Mantis), Elizabeth Debicki (Ayesha), Sean Gunn (Kraglin), Sylvester Stallone (Stakar Ogord), Will Poulter (Adam Warlock), Chukwudi Iwuji Le maître de l'évolution). 2h30. Les Gardiens vont combattre à nouveau Ayesha, la prêtresse des Souverains. Les Gardiens vont également faire face au créateur de Rocket, le Maître de l'évolution, qui veut le récupérer à tout prix, ils vont aussi devoir défier Adam Warlock, la création surpuissante d'Ayesha, prêt à tout pour les tuer