La reproduction ci-dessus a été prise après la récente restauration.
Différentes opinions s'affrontent parmi les historiens de l'art au sujet de l'épisode des évangiles décrit par cette dernière cène sans qu'aucune d'elles ne soit vraiment convaincante.
Certains considèrent qu'il s'agit du moment où Jésus annonce la présence d'un traître parmi les apôtres qui font alors part de leur étonnement. D'autres pensent qu'il représente la célébration de l'Eucharistie par Jésus qui désigne le pain et le vin de ses mains. Certains pensent aussi qu'il dépeint le moment où Judas, en cherchant à se saisir du pain au même moment que Jésus, se désigne comme le traître ( Luc, 22:21).
La dernière Cène de Léonard ne décrit pas une seule action mais entrelace les événements narrés par les évangiles depuis l'annonce de la présence du traître jusqu'au moment de l'Eucharistie. Ainsi les réactions des apôtres sont bien celles qui succèdent à l'annonce de la présence d'un traître alors que l'événement principal est bien celui de l'Eucharistie.
Les apôtres de gauche à droite : Bartolomeo, Jacques le mineur, André, Judas, Pierre, Jean, Le Christ, Thomas, Jacques le majeur, Philippe, Matthieu, Thaddeus, Simon.
Le tableau est construit de façon symétrique selon les lois de la perspective centralisée avec le personnage principal, Jésus, au centre. Il est physiquement et psychologiquement isolé des autres personnages. Ses mains dirigées vers le pain et le vin font du début de l'eucharistie l'élément central de la scène. Dans la conception de Léonard, les autres personnages réagissent directement en fonction de Jésus et certains en fonction les uns des autres.
Ainsi Jacques le majeur, situé sur la droite près de Jésus dont la bouche est grande ouverte d'étonnement, étend largement ses bras comme pour tenter de dire aux deux autres disciples derrière lui, qui essaient d'attirer l'attention du Christ avec leurs gestes éloquents et leur façon de se propulser en avant, qu'ils doivent se calmer et écouter.
Jacques le mineur, le second sur la gauche essaie de poser une main sur le dos de Pierre alors qu'André a coté de lui tient toujours ses mains levées devant lui et parle alors que ses yeux cherchent déjà Jésus.
Pierre et Jean se font face et semblent plongés dans une longue discussion alors que le groupe de trois disciples à l'extrême droite semble être plongé dans une discussion animée qui précède l'annonce de la présence d'un traître.
Le fait que celle-ci a pourtant bien été faite est prouvée par l'attitude de Jean et Pierre. En contradiction certes avec l'habituelle façon de les dépeindre dans laquelle Jean est appuyé contre la poitrine du christ. Mais Léonard se réfère à l'évangile de saint Jean (13:24) : "Simon Pierre cependant s'adressa à lui afin de de lui demander qui pouvait bien être celui dont on venait de parler."
En associant dans un même groupe ces deux apôtres et judas, Léonard rompt avec le schéma traditionnel qui dépeint Pierre et Jean assis chacun à la gauche et à la droite de Jésus lors de la dernière cène. Contrairement aux autres apôtres, il les caractérise cependant clairement afin qu'ils soient identifiables par le spectateur. Il identifie Pierre par le port d'une dague avec laquelle, à l'aube, il se servira pour couper l'oreille de Malchus, l'un des soldats venus arrêter le Christ.
Jean, le disciple favori porte des vêtements rouge et bleu comme Jésus et il est assis à sa droite, la place la plus honorifique. Mais c'est Judas qui est le mieux personnifié par Léonard parce qu'il n'est pas, comme d'habitude, placé au centre de la composition de l'autre coté de la table mais parmi la rangée des disciples. Il est identifié par différents motifs comme sa façon d'atteindre le pain, la bourse contenant la récompense de sa traîtrise et le fait qu'il renverse la salière, signe de malheur. Léonard exprime de même son isolement du groupe en en faisant le seul personnage dont le corps est penché vers la table se cachant presque dans le dos de Jésus.