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1912. Utah,1912 desert de Moab. Henry "Indiana" Jones, Jr. alors jeune scout rencontre des voleurs de tombes alors qu'il explorait des grottes avec sa troupe. Les voleurs découvrent le crucifix doré de Francisco Vázquez de Coronado, qu'Indiana leur vole, pensant que sa place est dans un musée. Indiana échappe aux voleurs qui le poursuivent et rentre chez son père, Henry, qui est plongé dans sa passion de toujours : la recherche du Saint Graal. Alors qu'Henry ignore Indiana, le shérif local arrive et force Indiana à rendre la croix au chef des voleurs portant un chapeau panama. Impressionné par ses efforts, il offre son feutre à Indiana, lui disant de ne pas accepter sa perte.
Vingt-six ans plus tard, en 1938, Indiana affronte le voleur sur un navire au large des côtes portugaises lors d'une tempête ; il récupèrele crucifix et s'échappe avant que le navire n'explose, tuant tous sesoccupants.
Après avoir repris son poste d'enseignant aux États-Unis, Indiana apprend que son père a disparu alors qu'il cherchait le Graal dont on dit qu'il accorde la vie éternelle, bien que l'Indiana méprise ses pouvoirs surnaturels. Le soutien financier d'Henry, Walter Donovan, charge Indiana de trouver Henry et le Graal. Indiana reçoit un colis contenant le journal du Graal d'Henry contenant toutes ses recherches et s'envole pour Venise avec Marcus Brody pour rencontrer la collègue autrichienne d'Henry, le Dr Elsa Schneider.
Sous la bibliothèque où Henry a été vu pour la dernière fois, Indiana et Elsa découvrent la tombe d'un chevalier de la Première Croisade enterré avec un bouclier inscrit révélant que le chemin vers le Graal commence dans l'ancienne ville d'Alexandrette. La Confrérie de l'épée cruciforme, une société dédiée à la protection du Graal, tente de tuer Indiana et Elsa, mais après avoir appris qu'Indiana ne s'intéresse qu'à retrouver Henry, révèle qu'il est en Autriche. Indiana confie à Marcus une carte du journal d'Henry montrant la route d'Alexandrette au Graal, et l'envoie à İskenderun, la ville construite au sommet des ruines d'Alexandrette, pour retrouver leur vieil ami Sallah. Indiana et Elsa découvrent que leurs chambres ont été saccagées, et Indiana révèle l'existence du journal du Graal d'Henry, et les deux dorment ensemble.
En Autriche, Indiana et Elsa s'infiltrent dans le château de Brunwald contrôlé par les nazis. Indiana trouve Henry, mais se rend après la capture d'Elsa par le colonel SS Ernst Vogel. Elsa et Donovan révèlent qu'ils travaillent avec les nazis pour récupérer le Graal et prendre le journal; pendant ce temps, Marcus est capturé à Iskenderun, avec le journal. Elsa retourne en Allemagne, tandis qu'Indiana et Henry s'échappent ensemble du château et sont poursuivis par les nazis. Ils se rendent en Allemagne et récupèrent le journal d'Elsa avant de s'enfuir à bord d'un dirigeable puis, plus tard, d'un biplan.
À Hatay, Sallah révèle que Donovan, Elsa et les nazis suivent la carte du Graal. L'expédition est attaquée par la Confrérie, qui sont tous tués ainsi que Vogel. Bien qu'Henry soit capturé, Indiana le sauve ainsi que Marcus.
Indiana, Henry, Marcus et Sallah poursuivent Donovan, Elsa et les nazis survivants jusqu'au lieu de repos du Graal dans le canyon du Croissant de Lune, mais sont capturés. Les nazis sont incapables de surmonter les pièges défensifs, alors Donovan tire mortellement sur Henry dans le but de forcer l'Indiana à obtenir le Graal. Désespéré de sauver son père, Indiana utilise le journal pour vaincre les pièges et fait un acte de foi à travers un large gouffre qui se révéle être un pont caché.
Il trouve une salle remplie de Graals, gardée par un chevalier de 700 ans. Le chevalier explique que les faux Graals prendront la vie du buveur. Elsa choisit un Graal extravagant dans lequel Donovan boit avant de vieillir rapidement et tomber en poussière. Indiana identifie correctement une simple tasse d'argile comme le vrai Graal, mais le chevalier avertit que le prix de l'immortalité est que le Graal ne peut pas quitter le temple. Indiana retourne vers Henry auquel il fait boiret l'eau du Graal ce qui guérit instantanément la blessure par balle, lui redonnant la santé. Elsa ignore l'avertissement du chevalier et tente de partir avec le Graal, mais le temple commence à s'effondrer. Elle fait une chute mortelle en tentant de récupérer le Graal alors que le sol se brise et Indiana subit presque le même sort jusqu'à ce qu'Henry le persuade de le laisser et de partir. Le chevalier leur fait ses adieux alors que le temple est détruit. Indiana, Henry, Sallah et Marcus partent au coucher du soleil.
Poursuivi par les trafiquants, il acquiert ses signes distinctifs : le fouet, le feutre cabossé, la cicatrice au menton et une phobie tenace des reptiles. A lafinHenry et "Junior " renonceront à l'objet tant convoité, ayant appris que la vraie richesse du Graal n'est pas dans sa possession, mais dans la sagesse qu'il permet d'acquérir.
Spielberg retrouve pour ce troisième épisode de la saga toute son invention pour constuire des scènes drôle et palpitantes, pleines de trappes et de surprises : entre Monument valley, la crypte vénitienne, le château allemand, etla citée de pierre etde sable à Petra en Jordanie. Astuces ou exploits accomplies par Indiana et M. Jones père, interprété avec élagance et malice par Sean Connery.