Le tableau, nommé aussi La Vierge au serpent, représente Marie qui, avec l'aide de Jésus, écrase un serpent à ses pieds, symbole du péché, assistée d'Anne, mère de la Vierge et protectrice des palefreniers, représentée comme une humble et vieille roturière, au visage ridé marqué par le temps.
Suite à la rénovation de la basilique Saint-Pierre au Vatican, le 31 octobre 1605, les membres de la puissante confrérie des Palafrenieri décidèrent de commander un nouveau retable, représentant la Vierge avec sainte Anne et l'Enfant, destiné à remplacer l'ancien tableau de Léonard da Pistoia et Jacopino del Conte qui, en raison de son format, n'était plus compatible avec les dimensions de la chapelle rénovée dédiée à Sainte Anne
le 1er décembre 1605, Le Caravage reçoit la première avance et la toile est exécutée en quelques mois et livrée par le peintre le 8 avril 1606 au doyen Antonio Tirollo qui, après l'avoir fait poser sur l'autel, ordonna son enlèvement. En effet, le 16 avril 1606, des porteurs sont chargés de retirer le retable de l'autel et de le transporter à l'église voisine de Sant'Anna dei Palafrenieri où, vu par le cardinal Scipione Borghese, il est acheté par lui le 20 juillet du même année pour la somme de 100 écus, chiffre supérieur à celui versé par la iconfrérie au Caravage (75 écus).
Selon la tradition, la toile fut rejetée car jugée trop réaliste et peu sacrée pour être exposée à la dévotion des fidèles, contrevenant de fait aux principes de bienséance établis par la Contre-Réforme concernant la représentation des sujets sacrés.
Tentant de renverser cette vision, Walter Friedländer (1954) et Jacob Hess (1954), ont démontré sur la base de preuves historiques que le refus n'était pas dû à des implications iconographiques ou dogmatiques, mais à l'impossibilité du sacellum pour accueillir la nouvelle toile, dont les dimensions dépassaient celles de la salle elle-même en hauteur. De plus, selon le savant, la tentative des frères d'arranger en quelque sorte le retable de la chapelle démontrerait leurs bonnes intentions, freinées cependant par les désirs de collection de Scipione, désireux de s'emparer de la peinture caravagesque.
De son côté, Luigi Spezzaferro (1974) estime que le refus est la conséquence du refus d'un autre tableau, La mort de la Vierge, peint par le Caravage pour Santa Maria delle Scala, qui nuit à cette toile par l'intermédiaire du cardinal pro-espagnol Tolomeo Gallion de Côme, consulté par les frères sollicitant de l'aide sur le sort du tableau. Selon l'érudit, en effet, le prélat a influencé l'opinion des mécènes qui ont dès lors opté pour le retrait de l'œuvre.
Au-delà de ces hypothèses, il est certain que la toile présente des solutions peu adaptées à une peinture dévotionnelle, comme la représentation excessivement humaine d'Anne qui, bien qu'étant la patronne des paffreniers, était représentée par le Caravage comme une vieille roturière, pleine de rides, dans une position de peu d'importance dans l'économie de la peinture (Settis 1975). Selon les critiques, en effet, cet apparent détachement de la sainte - dont le nom en hébreu signifie « grâce » - était considéré avec suspicion par l'Église, qui aurait lu une séparation évidente de la « grâce» de l'œuvre de salut de l'humanité. Sa figure, si particulièrement perturbante, a été comparée par Salvator Settis (1975) à la statue de Démosthène et à l'iconographie conséquente de la méditation, dont le modèle aurait été suggéré au peintre par le savant Giovanni Zaratini Castellini.
Par ailleurs, selon de nombreux érudits, deux autres détails ont dû apparaître comme particulièrement brûlants : la robe décolletée de la Vierge et la physionomie de l'enfant Jésus, jugé trop grand pour être saisi par sa mère, dont le geste - celui d'aider la Vierge à écraser la tête du serpent - pourrait être mal compris par les catholiques intransigeants. Le tableau, en effet, reproduit un passage célèbre du livre de la Genèse (3, 15) - "ipsa (ou ipso) conteret caput tuum" (celle-là [ou celui-ci] vous écrasera la tête) - un verset depuis des siècles au centre d'un conflit entre catholiques et luthériens. Les premiers, qui lisaient ipsa - c'est-à-dire la Vierge - reconnaissaient en Marie, symbole de l'Église, le pouvoir de vaincre le péché, contrairement à ce que soutenaient les protestants, qui déléguaient cette tâche uniquement au Fils (ipso). Ainsi le tableau du Caravage, montrerait peu d'implication de la Vierge dans larédemption.
Enfin, selon Maurizio Marini (1989), l'une des raisons qui a décrété le retrait de la toile de l'autel était la représentation de Lena, alias Maddalena Antognetti - dans le rôle de la Vierge, dont le choix aurait défié les directives de la Concile de Trente qui interdit la représentation d'individus reconnaissables dans le rôle de personnages sacrés.
Roberto Longhi (1928-1929) a plutôt répété que le Caravage, ignorant tous ces problèmes, s'était simplement inspiré pour l'exécution du tableau de la toile d'Ambrogio Figino, peinte pour l'église de San Fedele à Milan et représentant le même sujet ; thèse reprise et soutenue de nombreuses années plus tard également par Maurizio Calvesi (1986) qui, en plus de dater le tableau de 1606, a reporté à nouveau le rejet suiteà celui de la Mort de la Vierge.
Quelles que soient les véritables raisons, force est de constater que le cardinal Scipione profita de la situation pour se procurer le tableau, rapporté pour la première fois dans la collection Borghèse par Scipione Francucci (1613) : « Jésus et la Mère piétinent deux (sic !) aspics, du Caravage". Daté par Longhi de 1604-1606, le tableau a très probablement été exécuté entre les mois de septembre et décembre 1605, comme l'atteste la lettre de Gian Vittorio de' Rossi à Giovanni Zarattini Castellini, faite connaître par Paola della Pergola en 1958. En effet , le savant, à partir d'une épigramme de Zarattini Castellini - récemment découverte par Alice Maniaci (2020) - a placé le tableau dans la seconde moitié de 1605, une période où le Caravage est rappelé dans la maison du jurisconsulte Andrea Ruffetti.